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无论在基础研究还是在临床实践中，肿瘤的复发都是个机制复杂的棘手问题，实在是看它不爽又干不掉它，令人抓狂。今天我们要关注的TP53野生型乳腺癌对化疗的反应就比较一般，且此类患者生存率较差[1,2]。疗效不好的原因主要在于肿瘤细胞衰老、内源性死亡障碍和免疫逃逸。

(资料图片)

乳腺癌如何变成衰老状态从而抵抗化疗与免疫清除？化疗后用免疫检查点抑制剂（ICi）清除残余病灶的效果不佳[3]，罪魁祸首是这些衰老的细胞吗？这些问题都还没有答案。针对TP53基因型不同的肿瘤，如何安排化疗与ICi的先后顺序，也没有定论[4]。

近日，美国杜兰大学医学院的James G. Jackson副教授带领研究团队发现，乳腺癌化疗后的残留病灶呈现衰老表型，它的细胞组成也并不单一，这些细胞通过调控免疫检查点通路，减弱免疫治疗的效果。这项研究于12月8日发表在《自然·癌症》上。

本篇论文探究了化疗后肿瘤细胞免疫调节基因和免疫检查点表达水平的变化，为改善ICi治疗策略提供了重要的数据支持。

▲论文截图

研究人员首先建立了能够模拟化疗后衰老表型的小鼠Trp53野生型乳腺癌模型，他们发现，在患者残留病灶标本和小鼠模型中，抗原处理与呈递相关的基因均显著富集。这说明化疗之后，乳腺癌细胞在免疫水平上发生了从“冷”到“热”的转变，让免疫系统更容易发现它们；但另一些抑制免疫的分子也同时上调，抵消了化疗变“热”的作用。

▲免疫调节基因在残留病灶标本和模型中的表达情况

上述上调的免疫抑制基因中，因为CD274（编码PD-L1）和CD80这两个靶点已有对应的免疫治疗药物，所以研究人员针对它们开展了后续研究。

PD-L1和CD80在化疗后的衰老肿瘤组织中呈现显著的共表达特征，而在未接受化疗的肿瘤中几乎不表达。在细胞层面，PD-L1阳性的细胞通常为细胞角蛋白（CK）阴性、波形蛋白（vimentin）阳性，而CD80阳性的细胞则为CK阳性。结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）和标本中的免疫荧光验证结果，PD-L1和CD80在单个细胞水平上并没有显著的共定位现象。这样一来，PD-L1和CD80就分别对应着两群不同的细胞。

我们首先来看PD-L1。进一步分析scRNA-seq数据后，研究人员发现PD-L1阳性的这群细胞也高表达干扰素（IFN）相关基因。由于IFN调节PD-L1表达的作用已有文献报道[5,6]，所以化疗后乳腺癌残留病灶的PD-L1表达也很可能是IFN造成的！不过，IFNγ对普通的乳腺癌细胞并没有促进PD-L1表达的效果，只有当阿霉素处理后细胞出现衰老表型时，IFNγ才能促进包括PD-L1在内的多种免疫检查点基因表达。PD-L1要表达也绝非易事，阿霉素与IFNγ缺一不可。

为了明确阿霉素与IFNγ协同效应背后的机制，研究人员用ATAC-seq探究了阿霉素处理前后，染色质开放程度的变化以及转录因子的结合情况。结果显示在阿霉素处理后，PD-L1阳性的细胞中干扰素调节因子（IRF）家族更易与染色质结合，但在CD80阳性的细胞和未经阿霉素处理的细胞中均无此现象。

接下来，研究人员选择了IRF家族中表达水平最高的IRF1进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析。他们发现，有一类“Oasl2样基因”在阿霉素处理后染色质开放程度显著升高，此时再用IFNγ刺激，IRF1将被招募至对应的结合域，促进这些基因表达。对IFNγ反应如此灵敏，“干扰素调节因子”还真是名副其实。

▲阿霉素与IFNγ协同调节Oasl1样基因表达的模式图

在明确了PD-L1阳性细胞群对IFNγ的反应之后，研究人员将目光投向了CD80阳性的细胞群，这群细胞的DNA损伤和应激反应更为显著。不过，CD80并不像PD-L1那样需要IFNγ协助，只需阿霉素刺激，激活的p53被招募至CD80、CD86启动子区，就可以刺激细胞表达这些免疫检查点基因，加用IFNγ并不会进一步促进表达。甚至只要激活p53，非衰老的细胞也可以表达CD80。

到这里，我们已经知道了PD-L1和CD80两组细胞分别出现的原因，现在来看看它们在治疗中能派什么用场。化疗作用于上述两群细胞后，虽然可以改变部分免疫检查点基因的表达水平，但实际上CD45阳性的免疫细胞分群并没有明显变化，免疫细胞的数量和浸润程度也没有提高，说明仅凭化疗不足以刺激免疫系统做出反应。

于是，研究人员从PD-L1和CD80入手，探究了它们对应的ICi的效果。化疗后残留病灶中，ICi的应答基因确实有富集，不过在化疗后联合一种ICi对小鼠模型的治疗效果较为有限，化疗联合两种ICi可以缩小肿瘤体积并延长生存期。与单用化疗相比，化疗联合ICi可将肿瘤部位CD3阳性的T细胞比例提升10-18倍，并促进肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）聚集。不过，化疗联合两种ICi仍然没能在所有的肿瘤模型中均达到完全清除和治愈

▲阿霉素未处理（中）与处理后（左）肿瘤CD45阳性免疫细胞分群，左图为两组合并

这项研究告诉我们，“挺过”化疗后的肿瘤不光出现衰老表型，也在内部各立山头，分别表达不同的免疫调节分子。可惜单纯化疗不足以激活免疫系统，所以需要ICi出场。而p53野生型乳腺癌的化疗后残余病灶中，这两群差异较大的细胞也提醒我们，使用单一种类ICi还是很难完全清除肿瘤；即便化疗、抗PD-L1 和抗CTLA4三箭齐发，也还有漏网之鱼。

肿瘤组织中免疫治疗靶点的分布不仅存在空间上的异质性，也具有时间上的异质性，这对肿瘤的精准治疗提出了新的挑战。仍然有待发现更多的免疫治疗靶点，使ICi的覆盖范围更加全面。

参考文献：

[1] Ungerleider NA, Rao SG, Shahbandi A, et al. Breast cancer survival predicted by TP53 mutation status differs markedly depending on treatment. Breast Cancer Res. 2018;20(1):115. Published 2018 Oct 1. doi:10.1186/s13058-018-1044-5

[2] Shahbandi A, Nguyen HD, Jackson JG. TP53 Mutations and Outcomes in Breast Cancer: Reading beyond the Headlines. Trends Cancer. 2020;6(2):98-110. doi:10.1016/j.trecan.2020.01.007

[3] Chen N, Higashiyama N, Hoyos V. Predictive Biomarkers of Immune Checkpoint Inhibitor Response in Breast Cancer: Looking beyond Tumoral PD-L1. Biomedicines. 2021;9(12):1863. Published 2021 Dec 8. doi:10.3390/biomedicines9121863

[4] Sanmamed MF, Berraondo P, Rodriguez-Ruiz ME, Melero I. Charting roadmaps towards novel and safe synergistic immunotherapy combinations. Nat Cancer. 2022;3(6):665-680. doi:10.1038/s43018-022-00401-1

[5] Garcia-Diaz A, Shin DS, Moreno BH, et al. Interferon Receptor Signaling Pathways Regulating PD-L1 and PD-L2 Expression. Cell Rep. 2019;29(11):3766. doi:10.1016/j.celrep.2019.11.113

[6] Dong H, Strome SE, Salomao DR, et al. Tumor-associated B7-H1 promotes T-cell apoptosis: a potential mechanism of immune evasion [published correction appears in Nat Med 2002 Sep;8(9):1039]. Nat Med. 2002;8(8):793-800. doi:10.1038/nm730

本文作者丨初   一

责任编辑丨代丝雨